GB/T 23527.2-2025 酶制劑質(zhì)量要求 第2部分：脂肪酶制劑

范圍
本文件給出了脂肪酶制劑的產(chǎn)品分類，規(guī)定了技術(shù)要求、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和貯存，并描述了相應(yīng)的試驗(yàn)方法。
本文件適用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)和銷售。

術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
脂肪酶  lipase
能水解甘油三酯(含天然油脂)或脂肪酸酯產(chǎn)生單或雙甘油酯或甘油和游離脂肪酸，在特定條件下也能催化酯合成和酯交換反應(yīng)的酶。
脂肪酶制劑  lipase preparations
以脂肪酶為主要催化活性組分，通過(guò)制劑等工藝制得的產(chǎn)品。
注：制劑工藝中能加入有助于產(chǎn)品貯存、穩(wěn)定和使用的輔料。
脂肪酶活力  lipase activity
脂肪酶制劑的酶活力  activity of lipase preparations
1g固體脂肪酶制劑(或1mL液體脂肪酶制劑)含有的酶活力單位。
注1：以U/g(或U/mL)表示。
注2：在一定溫度和pH條件下，脂肪酶每分鐘水解底物產(chǎn)生1μmol的可滴定的脂肪酸，即為脂肪酶1個(gè)酶活力單位(以U表示)。也能根據(jù)所采用的酶活力測(cè)定方法，另行約定相應(yīng)的酶活力單位。

產(chǎn)品分類
按產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域
食品工業(yè)用和其他工業(yè)用脂肪酶制劑。
按產(chǎn)品的形態(tài)
固體劑型(含粉末劑型、顆粒劑型和固定化劑型)和液體劑型脂肪酶制劑。

要求
感官要求
應(yīng)符合表1的規(guī)定。


理化要求
應(yīng)符合表2的規(guī)定。


試驗(yàn)方法
酶活力
根據(jù)底物適應(yīng)性，測(cè)定水解橄欖油底物的酶活力時(shí)，按附錄A進(jìn)行檢測(cè)；測(cè)定水解三丁酸甘油酯底物的酶活力時(shí)，可參考附錄B。也可根據(jù)實(shí)際需求采用其他方法進(jìn)行檢測(cè)。

附錄A  (規(guī)范性)
脂肪酶制劑活力的測(cè)定滴定法
A.1 原理
脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油，所釋放的脂肪酸可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH計(jì)指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的堿量，計(jì)算其酶活力。
反應(yīng)式為：

A.2 試劑和材料
A.2.1 聚乙烯醇：聚合度1750±50。
A.2.2 橄欖油：試驗(yàn)試劑。
A.2.3 無(wú)水乙醇。
A.2.4 磷酸二氫鉀。
A.2.5 十二水磷酸氫二鈉。
A.2.6 NaOH。
A.3 溶液配制
A.3.1 聚乙烯醇溶液(4%)：稱取聚乙烯醇40g(精確至0.1g)，加水800mL，在沸水浴中加熱，攪拌，直至全部溶解，冷卻定容至1000mL。
注：根據(jù)乳化效果和溶解情況，也能選擇使用2％的聚乙烯醇溶液。
A.3.2 底物溶液：稱量聚乙烯醇溶液150g， 加橄欖油50g，用高速勻漿機(jī)10000r/min處理6min(分2次處理，間隔5min，每次處理3min)，水浴控制溫度，處理過(guò)程中溫度維持在60°C，處理結(jié)束后常溫下磁力攪拌20min。底物溶液顯微鏡觀察應(yīng)有80％以上的液滴直徑小于或等于3μm。該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。
注：也能選其他轉(zhuǎn)速，并根據(jù)乳化效果延長(zhǎng)或縮短均質(zhì)時(shí)間。
A.3.3 磷酸緩沖溶液(pH=7.5)：分別稱取磷酸二氫鉀1.96g和十二水磷酸氫二鈉39.62g，用水溶解并定容至500mL。如需要，調(diào)節(jié)溶液的pH至7.5±0.05。
A.3.4 NaoH標(biāo)準(zhǔn)溶液[c(NaOH)=0.05mol/L上按 GB/T 601 的規(guī)定配制與標(biāo)定0.5mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。使用時(shí)，準(zhǔn)確稀釋10倍。
注：也能采用商品化的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
A.3.5 乙醇溶液(95%，體積分?jǐn)?shù))。
A.3.6 酚酞指示液(10g/L)：按 GB/T 603 的規(guī)定配制。
A.4 儀器和設(shè)備
A.4.1 磁力攪拌水浴鍋：±0.2°C。
A.4.2 電子天平：感量0.1mg。
A.4.3 移液器。
A.4.4 酸度計(jì)：精度±0.01。
A.4.5 秒表。
A.4.6 高速勻漿機(jī)。
A.4.7 電位滴定儀。
A.4.8 光學(xué)顯微鏡。
A.4.9 微量滴定管：10mL，分刻度≤0.05mL。
A.5 分析步驟
A.5.1 樣品前處理
稱取酶樣品1.00g(精確至0.1mg)或1.0mL，加入適量磷酸緩沖溶液磁力攪拌溶解15min并稀釋，稀釋酶液采用玻璃器皿，測(cè)定時(shí)控制酶液濃度，樣品與對(duì)照消耗堿量之差控制在1.0mL~2.0mL范圍內(nèi)，吸取樣品時(shí)，應(yīng)將酶液搖勻后再取。
注：酶會(huì)附著在塑料上，因此用玻璃器皿溶解稀釋和滴定。使用塑料槍頭短時(shí)間轉(zhuǎn)移的情況除外。
A.5.2 測(cè)定
A.5.2.1 電位滴定法(仲裁法)
按電位滴定儀使用說(shuō)明書(shū)對(duì)儀器進(jìn)行校正(若使用酸度計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)， 則按照酸度計(jì)說(shuō)明書(shū)對(duì)酸度計(jì)進(jìn)行校正)。
取4個(gè)100mL燒杯，于空白杯(A)和樣品杯(B1、B2、B3)中各加入4.0mL底物溶液，5.0mL磷酸緩沖溶液，再于A杯中加入15.00mL 95％乙醇溶液。40°C±0.2°C水浴中磁力攪拌預(yù)熱5min，然后于空白杯(A)和樣品杯(B1、B2、B3)中各加1.00mL待測(cè)酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于樣品杯(B1、B2、B3)中立即補(bǔ)加15.00mL 95％乙醇溶液終止反應(yīng)。
在每個(gè)燒杯中加25mL蒸餾水，置于電位滴定儀上(若使用酸度計(jì)，則將酸度計(jì)電極放入燒杯中)，邊攪拌，邊用NOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至pH10.3為滴定終點(diǎn)，記錄消耗NOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。
注：對(duì)于某些脂肪酶樣品加入25mL蒸餾水影響酶活檢測(cè)結(jié)果，此類樣品在終止反應(yīng)后直接進(jìn)行NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。
A.5.2.2 指示劑滴定法
取2個(gè)100mL錐形瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸緩沖液5.00mL，再于A瓶中加入95％乙醇溶液15.00mL，于40°C±0.2°C水浴中預(yù)熱5min，然后于空白瓶(A)、樣品瓶(B)中各加待測(cè)酶液1.00mL，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于樣品瓶(B)中立即補(bǔ)加95％乙醇溶液15.0mL終止反應(yīng)，取出。
于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液兩滴，用NOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30s不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗NaoH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。
A.6 計(jì)算
脂肪酶制劑的酶活力按公式(A .1)計(jì)算：

式中：
X₁——樣品的酶活力，單位為酶活力單位每克或酶活力單位每毫升(U/g或U/mL)；
V₁——滴定樣品溶液時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升(mL)；
V₂——滴定空白溶液時(shí)消耗NaoH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升(mL)；
c ——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位為摩爾每升(mol/L)；
50——0.05mol/L NaOH溶液1.00mL相當(dāng)于脂肪酸50μmol；
n₁——樣品的稀釋倍數(shù)；
0.05——NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；
15——反應(yīng)時(shí)間15min。
A.7 結(jié)果表示
所得結(jié)果表示至整數(shù)。
A.8 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的差值應(yīng)不超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

附錄B  (資料性)
脂肪酶制劑活力的測(cè)定動(dòng)態(tài)滴定法
B.1 方法信息
B.1.1 原理
脂肪酶水解甘油三酯生成脂肪酸，使反應(yīng)體系的pH下降。通過(guò)連續(xù)加入堿的方法保持反應(yīng)體系的pH恒定。堿滴定的速率與酶活力成比例。酯酶的存在會(huì)使檢測(cè)的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在降解脂肪酶，從而使檢測(cè)到的脂肪酶的活力減小。
注：洗滌劑的存在會(huì)嚴(yán)重影響本方法。依不同洗滌劑的類型和濃度不同，這種影響表現(xiàn)為從抑制到激活。酶會(huì)附著在塑料上，因此用玻璃器皿溶解稀釋和滴定，使用塑料槍頭短時(shí)間轉(zhuǎn)移的情況除外。
B.1.2 反應(yīng)式
反應(yīng)式為：

B.1.3 反應(yīng)條件
反應(yīng)條件如下：
——溫度：30°C±1°C；
——pH：7.00；
——底物濃度：0.16mol/L的三丁酸甘油酯；
——反應(yīng)時(shí)間：至少1.5min(只有線性反應(yīng)區(qū)用于計(jì)算斜率)。
B.1.4 分析范圍
樣品的分析范圍為0.2U/mL~4.0U/mL。如果可能，所有樣品在1.5U/mL~4.0U/mL的范圍內(nèi)被分析。
B.1.5 檢測(cè)限
對(duì)于液體樣品，檢測(cè)限為20U/g，相當(dāng)于2.5g樣品溶解在10mL溶液中，然后再稀釋25倍。對(duì)于固體樣品，檢測(cè)限為50U/g，相當(dāng)于1.0g樣品溶解在10mL溶液中，然后再稀釋25倍。
B.2 儀器和設(shè)備
B.2.1 動(dòng)態(tài)滴定(pH-stat)功能的滴定儀。
B.2.2 乳化器。
B.2.3 恒溫水浴：精度±0.2°C。
B.2.4 溫度計(jì)：精度±0.2°C。
B.2.5 自動(dòng)移液器。
B.3 試劑
除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。
B.3.1 三丁酸甘油酯(C₁₅H₂₆O₆)。
B.3.2 氯化鈉(NaCl)。
B.3.3 磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)。
B.3.4 阿拉伯膠。
B.3.5 甘氨酸(H₂NCH₂COOH)。
B.3.6 甘油[HOCH₂CHCOH)CH₂OH]。
B.3.7 NaOH片劑(NaOH)。
B.3.8 電極校正液(pH7.0)。
B.3.9 電極校正液(pH4.01)。
B.3.10 乙醇溶液(96%，體積分?jǐn)?shù))。
B.3.11 氮?dú)?N₂)。
B.3.12 NaOH溶液[c(NaOH)=1mol/L]：按照 GB/T 601 的規(guī)定配制。
B.3.13 NaOH滴定液[c(NaOH)=0.025mol/L]：取NaOH溶液25mL，用水稀釋并定容至1000mL。配好后需用適宜的設(shè)備脫氣。
B.3.14 NaOH滴定液[c(NaOH)=0.005mol/L上取NaOH滴定液25mL，用水稀釋并定容至5000mL。
B.3.15 乳化劑：移取約180mL去離子水于500mL燒杯中，加入攪拌子高速攪拌，再緩慢加入30.0g阿拉伯膠，繼續(xù)攪拌至全部溶解。另取500mL燒杯，加入53.7g氯化鈉和1.20g磷酸二氫鉀，再加入350mL水充分溶解。將1620mL甘油置于3L容量瓶中，再依次加入上述氯化鈉-磷酸二氫鉀溶液和阿拉伯膠溶液，最后以水定容并混勻。
B.3.16 底物乳劑：稱取三丁酸甘油酯62.5g，分別量取乳化劑200mL和水940mL，混合。將混合液用勻漿器處理3min(7000r/min)。勻漿后的溶液先用普通的磁力攪拌器攪拌至少20min，然后調(diào)節(jié)pH至4.75±0.05。
注：不同來(lái)源和批號(hào)的三丁酸甘油酯和阿拉伯膠對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響，在更換產(chǎn)品或批號(hào)前需進(jìn)行有效性確認(rèn)。
B.3.17 甘氨酸緩沖液1(7.51g/L)：稱取甘氨酸37.54g和NaOH片劑18.5g，用水溶解并定容至5L。如需要，調(diào)節(jié)溶液的pH至10.8±0.05。
B.3.18 甘氨酸緩沖液2(0.75g/L)：取100mL甘氨酸緩沖液1，用水定容至1000mL。如需要，調(diào)節(jié)溶液的pH至10.8±0.05。
B.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品處理
B.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
稱取一定量的已知活力酶標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.0001g，用甘氨酸緩沖液2溶解并稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度為20U/mL。然后按照表B.1配制溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

B.4.2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照
可使用已知活力的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的處理同樣品。
B.4.3 樣品處理
不同的樣品需做不同的預(yù)處理，以激活或保護(hù)在樣品基質(zhì)中的脂肪酶。
可考慮采用甘氨酸緩沖液1和水來(lái)分別溶解和稀釋樣品的方法，或采用甘氨酸緩沖液2來(lái)溶解和稀釋樣品的方法，或直接用水溶解和稀釋樣品的方法，以求得到效果。樣品的溶解液和稀釋液需攪拌均勻。樣品最終稀釋到酶活力在1.5U/mL~ 4.0U/mL范圍內(nèi)。如可能，樣品稀釋完立即測(cè)定。
B.5 分析步驟
B.5.1 系統(tǒng)準(zhǔn)備
B.5.1.1 按照無(wú)水乙醇、適當(dāng)?shù)姆试硭崴⑷ルx子水、底物的順序清洗滴定容器和管路。保證水浴的溫度在30.0°C±0.5°C。
B.5.1.2 校正pH電極：使用前需校正pH電極的靈敏度在95%~102%；pH7.00在6.985~6.989之間；pH4.01在4.009~4.012之間。如果達(dá)不到此標(biāo)準(zhǔn)，按照pH電極使用說(shuō)明進(jìn)行沖洗并再次校正。
B.5.2 分析
B.5.2.1 pH 電極用后浸泡在飽和的KCl溶液中，使用前沖洗。在反應(yīng)溶液表面用氮?dú)獯党洌苑乐箍諝庵卸趸嫉母蓴_。分析前一定要保證底物的溫度為30.0°C±0.5°C。在分析每個(gè)樣品前要用0.005mol/L的NaOH滴定液沖洗滴定皿和管路。
B.5.2.2 試驗(yàn)步驟如下。
——將15mL的底物加入滴定皿中。滴定前pH電極的讀數(shù)應(yīng)小于7.0。
——加1mL樣品稀釋液加入滴定皿中。反應(yīng)體系的pH在滴定過(guò)程中保持在7.0。記錄為保持恒定pH而加入的滴定液的量。
——滴定結(jié)束后滴定儀打印出滴定曲線線性范圍的平均斜率(如果使用不同的設(shè)備，數(shù)據(jù)可能以其他形式輸出)。滴定曲線需有一段持續(xù)1.5min的線性輸出。
——先分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)分析一次)，再分析一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，最后分析樣品(每個(gè)樣品分析一次)。需注意， 一天內(nèi)非一次運(yùn)行的樣品不能使用相同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果樣品在當(dāng)天晚些時(shí)候分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液要重新分析。
——每個(gè)樣品分析前和后一個(gè)樣品完成分析后，系統(tǒng)將進(jìn)行沖洗。排空底物容器和管路，并用乙醇沖洗。如果系統(tǒng)將在一周以上時(shí)間不再使用，則需用去離子水進(jìn)行沖洗并用NaOH滴定液或相同濃度的鹽酸溶液充滿敏感部件，避免出現(xiàn)鹽類結(jié)晶。
B.6 計(jì)算
B.6.1 結(jié)果計(jì)算
利用標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的測(cè)定值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中X軸為標(biāo)準(zhǔn)品酶活力，Y軸為相應(yīng)的滴定反應(yīng)的平均斜率(mL/min)。標(biāo)準(zhǔn)曲線為一條直線。樣品稀釋液的活力從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出，然后按公式(B.1)計(jì)算：

式中：
X₂——樣品的酶活力，單位為酶活力單位每克(U/g)或酶活力單位每毫升(U/mL)；
A ——稀釋樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的酶活力，單位為酶活力單位每毫升(U/mL)；
V₃——樣品溶解用的容量瓶體積，單位為毫升(mL)；
n₂——第二次稀釋的倍數(shù)；
m₃——樣品的質(zhì)量或體積，單位為克(g)或毫升(mL)。
B.6.2 結(jié)果的確認(rèn)
當(dāng)滿足以下條件時(shí)可以確認(rèn)本次分析有效。
a) 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的檢測(cè)值在本方法所規(guī)定的可接受偏差范圍內(nèi)。
b) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率滿足：
1) 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)1小于0.02mL/min；
2) 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)6在0.14mL/min~0.18mL/min之間。
c) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r²)大于或等于0.995。
d) 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)3～點(diǎn)6相關(guān)系數(shù)(r²)大于0.9995。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)1～點(diǎn)2的r²大于0.995是可接受的。如果達(dá)不到此條件，檢查分析系統(tǒng)。
B.6.3 結(jié)果的表示
結(jié)果給出3位有效數(shù)字。如果結(jié)果低于檢測(cè)限，則表示為小于20U/g(液體)或小于50U/g(固體)。
B.7 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的差值應(yīng)不超過(guò)算術(shù)平均值的5%。


京都電子KEM 電位滴定儀&動(dòng)態(tài)滴定(pH-stat)功能的滴定儀 AT-710S